一提到細菌就害怕？別怕！細菌可以說是無處不在，它們和我們的身體和平共處。細菌也有“好壞”之分，有的細菌更是我們身體健康的“大功臣”！本期#材料輕Talk，讓我們來看看細菌作為載體有什么樣的治療應用與優(yōu)勢吧！

細菌對低氧、營養(yǎng)豐富和免疫抑制的腫瘤微環(huán)境表現(xiàn)出一定的趨化性，自身的鞭毛又可以使其具自主運動的能力，另外其擁有可操縱的基因和表面有豐富的基團，因此細菌毋庸置疑是介導腫瘤治療的良好載體。

細菌介導的腫瘤治療已經(jīng)有很長的歷史了，早在19世紀初就有醫(yī)生發(fā)現(xiàn)感染產(chǎn)氣莢膜梭菌的患者體內(nèi)的腫瘤消退。后來也有醫(yī)生通過瘤內(nèi)注射消退了患者的纖維肉瘤。但是由于當時醫(yī)療技術(shù)受限，細菌介導的腫瘤治療一度由于體內(nèi)無法控制的感染而被終止。直到20世紀90年代，隨著研究人員對腫瘤微環(huán)境和腫瘤免疫學更全面的了解，以及大量抗生素的發(fā)展，許多關(guān)于基因工程和合成生物學的研究開始研究活菌在癌癥治療中的應用。具有固有腫瘤定植能力的減毒細菌已被合理設計用于腫瘤靶向傳遞各種不同化合物，以增強基于細菌的癌癥聯(lián)合治療。下邊將對以細菌為載體的生物應用進行具體闡述。

▲  圖1：細菌為基礎的腫瘤治療應用[1]

   基因編輯

由于細菌的基因操縱的可行性好，易于控制，因此可以通過基因修飾來提高其有效性。目前，針對細菌進行腫瘤治療的基因編輯策略主要有四種:抗腫瘤細胞因子的表達、免疫調(diào)節(jié)劑的表達、成像引導信號蛋白的表達和前藥轉(zhuǎn)化酶表達。

（1）抗腫瘤細胞因子表達

在癌癥治療中，在保護健康組織的同時靶向輸送有毒藥物或蛋白質(zhì)是一種理想的策略。許多天然細胞毒性藥物，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、Fas配體和細胞溶血素A（ClyA）顯示出很有希望的細胞殺傷作用，但由于單一制劑的半衰期短和對肝功能的有害影響，這些藥物受到腫瘤暴露不足的限制。為了提高這些藥物的生物利用度，細菌被用來將它們直接輸送到腫瘤區(qū)域。Fan等人利用大腸桿菌MG1655設計了一種無創(chuàng)熱敏系統(tǒng)，該系統(tǒng)可通過口服給藥實現(xiàn)腫瘤光熱治療。該系統(tǒng)的一個優(yōu)點是，通過修飾在細菌上的生物礦化金納米粒子（AuNP）的光熱效應，腫瘤中TNF-a的表達可以局部調(diào)控。細胞溶血素作為一種造孔蛋白，通過在靶細胞膜上形成納米通道而引起細胞損傷。Ryan等人利用轉(zhuǎn)基因非致病性鼠傷寒沙門氏菌，將編碼細胞毒性溶細胞蛋白（HlyE）的基因傳遞到實體腫瘤的缺氧區(qū)域。結(jié)果表明，HlyE在血管化較差的腫瘤區(qū)域特異性表達，增強腫瘤壞死，抑制腫瘤生長

（2）免疫調(diào)節(jié)劑的表達

當細菌在腫瘤區(qū)域定植時，高度表達IL-2、CCL21和IL-18等免疫調(diào)節(jié)細胞因子的特制工程菌可以在原位增強顯著的免疫反應。作為細菌遞送系統(tǒng)中研究最多的細胞因子之一，口服或靜脈注射表達IL-2的沙門氏菌可預防動物模型中的腫瘤形成。Loefler等人使用減毒鼠傷寒沙門氏菌表達CCL21趨化因子以提高抗腫瘤效果。他們發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的炎性細胞浸潤顯著增加，相關(guān)的細胞因子和趨化因子如INF-γ、CXCL9和CXCL10也升高。這種免疫調(diào)節(jié)蛋白遞送系統(tǒng)可顯著抑制小鼠原發(fā)性腫瘤和肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的生長，且無明顯毒性。除了經(jīng)典的細胞因子和趨化因子外，腫瘤靶向細菌傳遞的其他蛋白也顯示出免疫調(diào)節(jié)作用。例如，異源鞭毛蛋白已被用作一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑。Zheng等人報道了分泌創(chuàng)傷弧菌鞭毛蛋白B（FlaB）的工程化鼠傷寒沙門氏菌ΔppGpp菌株在腫瘤微環(huán)境中誘導了顯著的宿主反應，并激發(fā)了M1樣巨噬細胞的激活，與親本菌株相比，這大大抑制了體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，延長了荷瘤小鼠的存活時間

（3）信號蛋白的表達

近年來，集成像和治療功能于一體的熱療藥物已成為抗腫瘤治療研究的熱點?；诩毦閷У纳锇l(fā)光和熒光的光學成像技術(shù)不僅可以檢測腫瘤中成功的細菌定位以預測其增殖，而且可以提高癌癥的診斷和治療。例如，Sae Ryung Kang等人使用18F-FDS PET來可視化腫瘤靶向大腸桿菌MG1655在CT-26荷瘤小鼠模型中的定植和增殖。攜帶細菌熒光素酶基因lux、RLuc8或GFP的鼠傷寒桿菌已被工程化，通過實時成像顯示其在腫瘤中的分布。這些成像技術(shù)能夠?qū)崟r監(jiān)測不同小鼠腫瘤模型中細菌向原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的遷移。

（4）表達前藥轉(zhuǎn)化酶

已建立的重組細菌可將非活性前藥在腫瘤部位轉(zhuǎn)化為活性形式，從而顯著提高局部藥物濃度，并減少全身給藥后的非靶向效應。例如，在小鼠模型和人類受試者中，使用沙門氏菌將胞嘧啶脫氨酶靶向傳遞到腫瘤組織導致5-氟胞嘧啶（5-FC）局部轉(zhuǎn)化為有毒的5-氟尿嘧啶（5-FU）。細菌酶羧肽酶G2已被用于將氮芥前藥轉(zhuǎn)化為DNA損傷劑，“自殺基因?qū)蚧煛贝蟠筇岣吡睡熜Ш桶踩?。然而，并非所有的前藥都可以通過細菌酶反應轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率受到系統(tǒng)生物合成和代謝活性的限制，這阻礙了它們的臨床應用。

 細菌/納米材料復合材料的構(gòu)建

除了基因改造細菌外，還有許多方法可以將細菌轉(zhuǎn)化為具有多種功能的抗癌藥物。根據(jù)細菌的不同治療應用，我們將這些方法分為三類：（1）細菌作為治療劑，通過納米合成技術(shù)進行修飾，以增強其腫瘤靶向性和穿透能力；（2）以細菌為載體，將生物合成技術(shù)與其他功能納米材料相結(jié)合，實現(xiàn)腫瘤的多功能診斷和治療；（3）細菌分泌物與納米材料結(jié)合以增強抗腫瘤效果和激活免疫反應。簡而言之，傳統(tǒng)納米材料的缺點，如靶向性差、人體識別速度快、副作用嚴重等，只要與細菌結(jié)合，無論細菌是作為治療劑、靶向載體還是免疫激活劑，都可以在很大程度上解決，它可以顯著提高抗腫瘤效果，為開發(fā)新的抗腫瘤治療策略提供了強大的潛力。

（1）細菌表面“隱形衣”構(gòu)建

由于細菌進入宿主體內(nèi)后，不可避免地會被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬和清除。因此，通過表面修飾的工程菌可以延長其在循環(huán)中的滯留時間進而提高腫瘤部位的優(yōu)先聚集來進一步提高抗腫瘤效果。合成聚合物、脂質(zhì)體和生物膜等均可用于細菌表面修飾，以提高其診斷、成像和治療的安全性和效率。例如使用紅細胞膜包裹大腸桿菌用于延長其在血液中的長循環(huán)時間進而增強腫瘤部位蓄積。再如，使用具有光熱吸收功能的多巴胺包裹沙門氏菌可以增強其光熱治療腫瘤效果。

（2）遞送化療藥物

化療是臨床治療惡性腫瘤最常用的策略之一。然而，由于腫瘤缺氧區(qū)畸形的血管和較高的間質(zhì)壓，大多數(shù)藥物載體從腫瘤血管系統(tǒng)“泄漏”并分布在周圍區(qū)域，這反過來又將藥物劑量降低到次優(yōu)水平，降低了治療效果。而細菌載體可以將化療藥物遞送并釋放到更深的腫瘤區(qū)域。例如使用pH不穩(wěn)定的順式乙酸酐連接劑將阿霉素（DOX）連接到大腸桿菌Nissle 1917（EcN）上，構(gòu)建了一種藥物偶聯(lián)細菌游泳者（EcN ca DOX）。EcN ca DOX在腫瘤中積累，并以可控、酸反應的方式緩慢釋放藥物。靜脈注射EcN ca DOX 3小時和3天后，腫瘤中的DOX累積量分別為每克組織注射劑量的12.9%和6.4%，而單劑量治療組腫瘤部位的DOX幾乎完全消除。Suh等人開發(fā)了一種納米級細菌自主給藥系統(tǒng)（NanoBEADS），在沒有任何外部刺激的情況下，將輸送至實體腫瘤的納米粒子數(shù)量增加了近100倍。最近，開發(fā)了新型細菌微丸，用于上傳、輸送和卸載封裝DOX和a-生育酚琥珀酸鹽的混合膠束。由于在細胞核和線粒體中分別同時釋放DOX和a-生育酚琥珀酸，膠束和細菌的結(jié)合實現(xiàn)了協(xié)同抗腫瘤作用。此外，F(xiàn)elfuight等人使用磁性趨氣細菌海洋磁球菌MC-1菌株將載藥納米脂質(zhì)體輸送到腫瘤的氧-缺氧過渡區(qū)（OATZ）。同樣，Zoaby等人將DOX載藥納米脂體整合到沙門氏菌上，沙門氏桿菌通過其自主推進能力快速遷移到低pH和高葡萄糖水平的腫瘤區(qū)域。與此相一致，Nguyen等人發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌能夠?qū)⒆仙即贾|(zhì)體輸送到腫瘤組織，與游離藥物包裹的脂質(zhì)體相比，其具有更大的功效，因為其具有較高的運動性和向腫瘤的傾向性，從而具有更好的抗腫瘤效果。

（3）與光熱治療結(jié)合

光熱治療的效果如何取決于光熱劑的光熱轉(zhuǎn)換效率和腫瘤中的選擇性蓄積。然而，目前使用的光熱劑在腫瘤中的積累相對較差，這限制了其臨床療效。細菌可以顯著改善光熱劑在腫瘤壞死和缺氧區(qū)域的分布。Luo等人報告說，厭氧菌可以將納米材料輸送到缺氧腫瘤區(qū)域進行成像和PTT。Chen等人設計了一個生物/非生物雜交系統(tǒng)，該系統(tǒng)由高能動性鼠傷寒沙門氏菌株YB1和負載光敏劑吲哚青綠（INPs）的NPs組成，用于靶向大型膀胱腫瘤(≥500毫米3）。YB1增強了INP對腫瘤缺氧部位的滲透，在近紅外（NIR）激光照射后，INP能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤細胞的光熱裂解。因此，釋放的營養(yǎng)素進一步吸引了細菌，并使腫瘤部位的YB1 INP積累量增加了14倍，與未輻照對照組相比。因此，YB1 INPs通過PTT抑制大實體瘤的生長，且無復發(fā)。Chen等人利用沙門氏菌VNP20009的腫瘤靶向能力將多聚多巴胺運輸?shù)饺毖跄[瘤區(qū)域，進行PTT和免疫治療的聯(lián)合，PTT導致腫瘤細胞消融并釋放大量腫瘤相關(guān)抗原，從而引發(fā)免疫反應。沙門氏菌和PD-1阻斷劑通過阻斷免疫檢查點進一步增強抗腫瘤反應。這種策略抑制了大型黑色素瘤的生長，并防止其復發(fā)。

（4）與光動力治療結(jié)合

光動力治療因其侵襲性小、副作用少和耐藥風險低而被廣泛用于癌癥治療。它使用光敏劑光激活后產(chǎn)生活性氧（ROS），進而誘導細胞凋亡、壞死和組織破壞。然而，由于缺氧性腫瘤微環(huán)境以及光敏劑的耗氧量進一步加劇腫瘤部位的缺氧，光動力的療效有限。放氧納米材料可以緩解腫瘤缺氧，增強光動力的作用。同樣，產(chǎn)氧光合細菌可以潛在地改善光動力期間的腫瘤氧合。由于藍藻菌株Syenchoccus 7942（Syne）具有腫瘤靶向性和原位光催化產(chǎn)氧能力，因此可以被用作光動力的供養(yǎng)菌。Liu等人利用分子間二硫鍵組裝光敏NP（HSA/ICG），并通過酰胺鍵將其結(jié)合到Syne細胞壁上。由此產(chǎn)生的仿生系統(tǒng)（S/HSA/ICG）實現(xiàn)了光敏劑的靶向腫瘤遞送，并通過原位產(chǎn)生高水平氧氣。

S/HSA/ICG NPs的光合作用在腫瘤中富集，并在激光照射下持續(xù)產(chǎn)生氧氣，顯著緩解腫瘤缺氧，從而完全逆轉(zhuǎn)免疫抑制性TME，增強光動力治療效應。另一組通過酰胺反應將PS氯e6（ce6）附著在藍藻表面，為光動力治療合成了類似的藍藻/PS雜交。在660 nm激光刺激下，雜交系統(tǒng)通過光合作用產(chǎn)生O2，PS將其轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧。這種正反饋級聯(lián)在低劑量ce6的17.9倍下，實現(xiàn)了與傳統(tǒng)ce6介導的光動力治療相似的光動力效應，并成功地在異種移植模型中消融了腫瘤生長。細菌生物礦化也應用于光動力治療。

此外細菌還可以通過基因編輯手段用于表達抗腫瘤血管生成因子。通過生物合成技術(shù)用于遞送溶瘤病毒或者放射性材料用于腫瘤的多功能療法。除了上述利用細菌作為生物載體外，細菌的天然佐劑成分還可以有控制地刺激免疫成熟和誘導炎癥，增加腫瘤免疫浸潤。雖然細菌具有自主驅(qū)動性、腫瘤靶向性、易操縱的基因等等優(yōu)勢使其在腫瘤治療領(lǐng)域有了新的用途。毋庸置疑的是，細菌的自主繁殖可能會給機體帶來不可控的感染風險。

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特別鳴謝：劉瑤

參考文獻：

[1] Bacterial-based cancer therapy: An emerging toolbox for targeted drug/gene delivery, Biomaterials,10.1016/j.biomaterials.2021.121124

[2] Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy, Nat Rev,Canc

er, 10.1038/nrc2934

[3] Bacteria-Based Cancer Immunotherapy, Adv Sci,10.1002/advs.202003572